线粒体膜电位简介
线粒体是动植物细胞中ATP产生的主要场所，也是促进细胞能量转换和参与细胞凋亡的重要细胞器。线粒体将呼吸氧化过程中产生的能量以电化学势能的形式储存在线粒体内膜上，导致内膜两侧质子和其他离子浓度分布不对称，从而形成线粒体膜电位（MMP，ΔPSIm）。正常的MMP是维持线粒体氧化磷酸化和产生三磷酸腺苷（ATP）的先决条件。MMP的稳定性有利于维持细胞正常的生理功能。
图1：线粒体膜电位（Zorova等，2017）
为什么要测量线粒体膜电位？
线粒体是细胞能量和代谢的重要调节器，在维持细胞生长和存活方面发挥着至关重要的作用。线粒体的核心功能是通过氧化磷酸化合成ATP，这是线粒体生物能量学中众所周知的过程。ATP的产生与线粒体膜电位密切相关。线粒体通过电子传递链产生的膜电位梯度来维持氧化磷酸化并驱动ATP合成。这一步骤是通过位于线粒体内膜上的质子泵完成的，该质子泵可以将质子（H+）从线粒体基质泵入膜间隙。质子的跨膜运输使大量质子在线粒体膜间隙中积累，从而在线粒体内膜两侧形成跨膜电位，即线粒体膜电位。当质子返回时，它们驱动ATP的生成，ATP是生物体最重要的能量货币。人体内95%的ATP由线粒体提供。
正常情况下，线粒体内膜电位较高，呈负电位，而外膜电位较低，呈正电位。当某些因素阻碍线粒体呼吸链的电子传递过程，影响线粒体基质中质子（H+）跨膜梯度的形成时，会导致线粒体膜电位降低，即去极化，表现为外膜正内膜负。大量研究表明，线粒体膜电位的降低与自噬、细胞凋亡或坏死有关。线粒体膜电位功能障碍，即使是轻微的异常变化，也可能极大地影响细胞的生物活性，并导致多种疾病（如阿尔茨海默病、糖尿病、癌症等）。
因此，线粒体膜电位是评价线粒体正常功能的重要指标之一。它不仅反映线粒体功能的完整性，而且对三磷酸腺苷（TP）的合成、离子转运、细胞凋亡的调控以及抗氧化活性均有重要影响。同时，它也反映细胞的健康状况，对细胞的存活和发育具有重要意义。此外，检测线粒体膜电位的变化对于生物学研究和医学诊断具有重要意义。因此，我们应该关注线粒体膜电位的变化，并采取相应的措施来保护线粒体的正常功能。
线粒体膜电位检测方法
目前，荧光探针是评估线粒体膜电位最常用的方法。这些探针——包括 JC-1、Rh123、TMRM、TMRE 和 DiOC6——通常由亲脂性阳离子化合物组成，它们在线粒体膜基质空间中的积累量与 ΔΨm 成反比。
JC-1 探针
JC-1 是一种理想的荧光探针，广泛用于检测细胞、组织或纯化样品中的线粒体膜电位。它独特的性质使其能够在健康线粒体中形成聚集体（红色荧光），在去极化的线粒体中形成单体（绿色荧光），从而可以对线粒体膜电位 (MMP) 进行定性和定量评估。
罗丹明 123 探针
Rh123 是一种细胞渗透性阳离子荧光染料，易于被活性线粒体螯合，且无细胞毒性作用。其荧光强度随膜电位的降低而降低，因此可用于测量 MMP 的变化。
TMRM/TMRE探针
四甲基罗丹明甲酯 (TMRM) 和乙酯 (TMRE) 是细胞渗透性染料，它们根据能斯特方程在线粒体和胞质溶胶之间分布。它们是定量测量膜电位的理想选择。
DiOC6探针
DiOC6(3) 是一种碳菁染料，可对活细胞中的线粒体进行染色，其积累取决于线粒体膜电位。它常用于流式细胞术。
JC-1检测原理
JC-1染料以电位依赖的方式在线粒体中积累，呈现多色荧光发射光谱，并可用于对线粒体去极化进行比例半定量评估。在正常线粒体中，JC-1在线粒体基质中聚集形成聚合物，发出强烈的红色荧光；当化合物诱导线粒体膜电位崩溃时，由于膜电位降低或丧失，JC-1只能以单体形式存在于细胞质中，并发出绿色荧光。这意味着在健康细胞中，会出现少量绿色荧光，而大部分为红色荧光；大多数线粒体去极化的细胞仅显示绿色荧光。因此，线粒体膜电位的变化可以通过荧光颜色的变化来反映，或者可以通过红/绿荧光强度比值来测量线粒体去极化的程度。
JC-1单体的激发波长为488或514nm，发射波长约为529nm的绿色荧光；JC-1聚合物的最大激发波长为585nm，发射波长约为590nm的红色荧光。JC-1可通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计或流式细胞仪进行检测。
图 2：JC-1 进入线粒体及聚集体形成（Sivandzade 等，2019）
实验步骤
CCCP 是一种可逆质子梯度解偶联剂，能够快速降低线粒体膜两侧的电化学势，导致细胞内线粒体快速去极化。因此，CCCP 处理的细胞可作为 JC-1 检测的阳性对照。CCCP 处理后，线粒体膜电位完全丧失，JC-1 染色呈绿色荧光，而正常细胞在 JC-1 染色后应呈红色荧光。
1. 细胞染色
1.1 悬浮细胞
（1）细胞接种：以 6 孔板为例，将 100 万个细胞重悬于每孔 1 mL 培养基中，其他培养皿重复此步骤。您也可以根据自身细胞类型选择合适的接种密度。
（2）设置阳性对照：取适量CCCP处理细胞，置于37℃细胞培养箱中孵育5分钟。
（3）JC-1染色：加入适量JC-1，置于37℃细胞培养箱中孵育15分钟。通常15分钟即可达到充分染色。
（4）离心：37℃孵育后，4℃下以400g离心3-4分钟，弃去上清液，尽量避免去除细胞沉淀。
（5）洗涤：用1×PBS洗涤两次，4℃下以400g离心3-4分钟。
（6）结果检测：将细胞重悬于500 μL PBS中，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，或使用荧光分光光度计或流式细胞仪进行分析（绿色荧光：激发/发射波长=510/527nm；红色荧光：激发/发射波长=585/590nm）。
1.2 贴壁细胞
若使用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先消化收集贴壁细胞，重悬后参照悬浮细胞的检测方法。若使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行检测，则直接参照悬浮细胞实验的步骤和方法。
注意事项
CCCP是一种线粒体电子传递链抑制剂，对人体有害。实验过程中，必须穿戴实验服和一次性手套，并注意防护。
JC-1对光敏感，所有染色步骤在操作过程中均应避免强光照射。未使用的储存液应避光保存，避免反复冻融。
JC-1染色完成后，应立即进行后续结果分析，以减少各种可能的误差。
参考文献
[1]
Sivandzade F, Bhalerao A, Cucullo L. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5; 9(1):e3128.[2] Zorova LD, Popkov VA, Plotnikov EY, et al. Mitochondrial membrane potential. Anal Biochem. 2017 Jul 1; 552:50-59.
[2] Zorova LD, Popkov VA, Plotnikov EY, et al. Mitochondrial membrane potential. Anal Biochem. 2017 Jul 1; 552:50-59.