故障排除指南：ELISA
问题：预期出现信号时未出现信号
问题：信号过强 - 整块板均匀变蓝
问题：标准曲线已获得，但各点之间的区分度差（曲线低或平坦）
问题：重复性差
问题：检测间重复性差
问题：预期出现信号时未出现信号，但标准曲线看起来正常
问题：样本读数过高，但标准曲线看起来正常
问题：整个板的读数非常低
问题：使用链霉亲和素-HRP 时，加入终止液后出现绿色
问题：边缘效应
问题：漂移
1. 背景过高 问题卡片
问题：背景过高可能原因
| 测试或措施 | 洗涤次数不足 |
|---|---|
| 增加洗涤次数；在每次洗涤之间增加 30 秒浸泡步骤 | 2. 预期出现信号时未出现信号 问题卡片 |
可能原因
| 测试或措施 | 试剂添加顺序错误或配制错误 |
|---|---|
| 重复检测；检查计算并配制新的缓冲液、标准品等 | 检查实验方案 HRP 被 |
| 污染使用新鲜试剂 | 抗体用量不足 |
| 增加浓度 | 标准品变质（如果样品孔中有信号） |
| 检查标准品是否按照说明操作。 | 使用新的试剂瓶。 含有胎牛血清 (FCS) 的缓冲液用于重组抗体 |
| 重新验证您选择的试剂 | 捕获抗体未与酶标板结合 |
| 使用 ELISA 板（而非组织培养板） | 用不含额外蛋白的 PBS 稀释 缓冲液被污染 |
| 配制新鲜缓冲液 | 3. 信号过强 - 整块板均匀变蓝 |
可能原因
| 测试或措施 | 洗涤不充分/跳过洗涤步骤 - 残留未结合的过氧化物酶 |
|---|---|
| 确保步骤之间彻底洗涤。 | 底物溶液过早混合并变蓝 |
| 底物溶液应立即混合并使用 | 链霉亲和素-HRP 过量 |
| 检查稀释度，必要时进行滴定 | 重复使用封板膜或试剂槽，导致残留 HRP。这将使 TMB 非特异性地变蓝 |
| 每一步都使用新鲜的封板膜和试剂槽 | 缓冲液被金属或 HRP 污染 |
| 配制新鲜的缓冲液 | 4. 标准曲线已获得，但各点之间的区分度差 |
可能原因
| 测试或措施 | 链霉亲和素-HRP 不足 |
|---|---|
| 检查稀释度，必要时进行滴定 | 捕获抗体与板结合不良 |
| 使用 ELISA 板（而非组织培养板） | 用 PBS 稀释，无需添加其他蛋白质 检测抗体不足 |
| 检查稀释度，必要时进行滴定 | 显色时间不够 |
| 增加底物溶液孵育时间 | 使用推荐品牌的底物溶液 操作步骤错误 |
| 返回通用 ELISA 方案；如有修改，请排除 | 标准曲线稀释度计算不当 |
| 检查计算结果，重新绘制标准曲线 | 5. 重复性差 |
可能原因
| 测试或措施 | 洗涤不足 |
|---|---|
| 如果使用自动洗板机，请检查所有端口是否清洁无堵塞，增加 30 秒浸泡步骤，并在洗涤过程中旋转洗板一次 | 由于操作错误或洗板机质量差导致包被不均匀（可能结合不均匀） |
| 用 PBS 稀释，无需添加其他蛋白质 | 检查包被和封闭的试剂用量、时间和添加方法。检查所用板 使用 ELISA 板（而非组织培养板） 重复使用封板膜 |
| 每一步都使用新的封板膜 | 未使用封板膜 |
| 使用封板膜 | 缓冲液污染 |
| 配制新的缓冲液 | 6. 检测间重复性差 |
可能原因
| 测试或措施 | 清洗不充分 |
|---|---|
| 如果使用自动洗板机，请检查所有端口是否清洁且无堵塞 | 孵育温度变化 |
| 遵循推荐的孵育温度 | 避免在环境条件变化较大的区域孵育板 实验方案变化 |
| 每次运行都遵循相同的实验方案 | 重复使用封板膜，导致残留 HRP，使 TMB 变蓝 |
| 每一步都使用新的封板膜 | 标准曲线稀释度计算不当 |
| 检查计算，重新绘制标准曲线 | 使用内对照 缓冲液污染 |
| 配制新的缓冲液 | 7. 无信号预期出现信号，但标准曲线看起来正常 |
可能原因
| 测试或措施 | 样本中无细胞因子 |
|---|---|
| 使用内部对照 | 重复实验，重新考虑实验参数 样本基质掩盖了检测信号 |
| 用合适的稀释液将样本至少稀释 1:2，或者最好进行一系列稀释以观察回收率 | 8. 样本读数过高，但标准曲线看起来正常 |
可能原因
| 测试或措施 | 样本中细胞因子水平高于检测范围 |
|---|---|
| 稀释样本并重新运行 | 9. 整个板的读数非常低 |
可能原因
| 测试或措施 | 波长错误 |
|---|---|
| 检查滤光片/读数仪 | 显色时间不足 |
| 增加显色时间 | 包被板老化失效 |
| 包被新板 | 捕获抗体未与包被板结合酶标板 |
| 使用 ELISA 板（而非组织培养板） | 用 PBS 稀释，无需添加其他蛋白 使用含 FCS 的缓冲液来复溶抗体 |
| 重新验证您选择的试剂 | 10. 使用链霉亲和素-HRP 时，加入终止液后出现绿色 问题卡片 |
可能原因
| 测试或措施 | 孔内试剂混合不均匀 |
|---|---|
| 轻敲酶标板 | 11. 边缘效应 问题卡片 |
可能原因
| 测试或措施 | 工作台面周围温度不均匀 |
|---|---|
| 避免在环境条件变化较大的区域孵育酶标板 | 使用封板膜 |
| 12. 漂移 问题卡片 |
可能原因
| 测试或措施 | 检测设置中断 |
|---|---|
| 检测设置应连续进行 - 在开始检测前，所有标准品和样品均应正确制备 | 试剂未达到室温 |
| 确保所有试剂在移液前均达到室温除非抗体说明书另有说明，否则请将抗体加入孔中。 | Ensure that all reagents are at room temperature before pipetting into the wells unless otherwise instructed in the antibody inserts |