细胞实验

There is no "universal loading control", only the most suitable loading control for your experimental conditions. The key is to make a reasonable selection based on your cell line/tissue source, treatment conditions, and the molecular weight of the target protein.

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is an essential process during development whereby epithelial cells acquire mesenchymal, fibroblast-like properties and display reduced intracellular adhesion and increased motility. This is a critical feature of normal embryonic development, which is also utilized by malignant epithelial tumors to spread beyond their origin.

Cellular Localization IF (Immunofluorescence) is an experimental method based on immunofluorescence technology, used to observe the distribution of specific antigens within cells.

Cell fractionation is the process of separating cellular components, such as organelles, proteins, and other macromolecules, from the entire cell.

在基因功能研究领域，过表达、基因敲除、基因敲低是调控基因表达、解析基因功能的三大核心实验技术。本文分别阐述了三种技术的作用原理、作用水平及主流实现方式，同时梳理了对应的通用验证方法与针对性补充检测手段，清晰区分三者的应用差异，可为科研人员根据实验需求合理选择技术方案、规避实验误区提供参考。

稳定表达细胞株是基因功能研究、蛋白表达及相关体内外实验的重要工具。本文阐述了稳转细胞株的定义与构建原理，介绍了G418、潮霉素、嘌呤霉素三类常用抗性筛选标记，总结了稳转株在长期基因研究、基因沉默、表达调控、诱导表达及动物模型搭建等方面的应用价值。同时重点说明慢病毒载体构建稳转株的优势，并完整梳理了从抗生素浓度测定、病毒 MOI 优化、载体制备、细胞感染、药物筛选到细胞鉴定的全套标准实验流程，可为相关细胞实验开展提供参考。 关键词

RNA 干扰是一类由非编码 RNA 介导的转录后基因沉默机制，凭借序列特异性实现靶基因表达抑制。本文主要介绍miRNA、siRNA、shRNA三类核心 RNA 的结构特征，分别阐述 miRNA 翻译抑制、siRNA 靶向切割 mRNA 的分子作用机制，并对比三种干扰工具的来源、结构、作用特点与适用场景，同时结合实验需求给出选型建议。此外，总结了 RNA 干扰技术在基础生命科学、医药研发、农业生产等领域的应用方向，可为该技术的理论研究与实际实验应用提供参考。 关键词

CRISPR-Cas9 是当下主流的基因编辑技术，依托 Cas9 蛋白与向导 RNA 的协同作用实现 DNA 定点修饰。本文分别介绍该技术基因敲除、基因敲入、基因抑制与激活三大核心应用原理：利用 DNA 断裂后的非同源末端连接修复实现基因敲除；借助同源重组修复完成外源基因敲入；通过失活型 dCas9 可逆调控基因表达。同时结合基因功能研究、疾病模型构建、遗传病治疗、药物靶点筛选等场景，阐述了 CRISPR-Cas9 技术在生命科学、医学领域的实际应用，展现了该技术广阔的研究与临床价值。

CRISPR-Cas9 技术源于细菌天然的病毒防御免疫系统，是当下主流的基因编辑工具。该系统主要由 Cas9 蛋白、向导 RNA 两大核心组分构成，同时依赖 PAM 序列保障切割特异性。其编辑过程分为识别、切割、修复三个阶段，细胞针对 DNA 双链断裂存在非同源末端连接、同源定向修复两种修复机制，科研人员可利用不同修复方式，实现基因敲除、精准替换与插入等编辑操作。本文对该技术的原理、组成及作用流程进行了完整解读。

肥胖的特征是脂肪组织的质量或功能随着能量获取和消耗的失衡而增加，它与糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝和某些癌症等代谢性疾病密切相关。脂肪库的扩张（尤其是白色脂肪组织）以脂肪细胞体积增加（肥大）或由前体细胞形成新脂肪细胞（增生）为特征。因此诱导细胞成脂在肥胖相关疾病的机制研究和药物开发中发挥重要的作用。 成脂分化（Adipogenic Differentiation）是间充质干细胞（MSCs）或前脂肪细胞在特定条件下诱导分化为成熟脂肪细胞的过程，可以通过油红O染色染色评估脂肪分化程度。3T3-L1是成脂分化最常用的细胞类型。 Tips： 脂肪可分为白色脂肪和棕色脂肪。 成熟白色脂肪细胞含有许多体积较大的单房脂滴，细胞呈多边形，细胞核位于细胞的边缘，并含有少量的线粒体。marker基因包括Agt、Retn/Resistin、Slc2a4/Glut4、Cfd/Adiposin、Adipoq/Adiponectin及Fabp4/aP2。 棕色脂肪细胞含有多房小脂滴，是富含线粒体的一种产热细胞。marker基因包括DIO2、PPARα、PRDM16及UCP1等。 细胞选择 3T3-L1：成脂定向性和重复性好；但属于小鼠来源细胞，与人源具有一定差异。 hMSCs：人源骨髓MSCs，临床相关性高，但分化效率低（30%左右）。 hADSCs：人脂肪来源间充质干细胞，分化效率高效，但供体个体差异大。 成脂分化实验步骤（以RC0044产品诱导3T3-L1为例） 1.取对数生长期的细胞，按照2.0×10e4 cells/cm2 的细胞密度接种至培养器皿，于37℃，5% CO2 培养环境下培养至汇合度90~100%。 2.弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液于37℃，5% CO2 培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天，并注 意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。 3.吸去培养基使用适量 1×PBS 清洗一次，弃去后取适量 4%多聚甲醛(PFA)溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60 min，弃去固定液再使用1×PBS 清洗两次。 4.取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液（油红O原液: 生理盐水=3:2），配制后过滤使用，现用现配。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红O工作液，静置染色30 min。吸走油红O工作液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。 5.显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红O染料结合后呈现红色或橘红色。 EnkiLife成脂诱导培养基诱导出来的照片 图1.成脂诱导后油红O染色效果图_20.0x-1 图2.成脂诱导后油红O染色效果图_20.0x-2 图3.未经成脂诱导油红O染色效果图_20.0x-1 图4.未经成脂诱导油红O染色效果图_20.0x-2 常见问题及解析 1.脂滴形成少 细胞密度不足，未达到接触抑制导致诱导失败；在进行成脂诱导时需确保细胞生长至90~100%密度时再开始诱导。 诱导剂失效导致诱导失败；胰岛素需避光保存并避免反复冻融；地塞米松需避光保存。 4%多聚甲醛(PFA)固定过度导致脂滴结构被破坏，固定时间一般为30-60 min；建议根据结果优化固定时间。 油红O染液结晶导致染色失败；油红O染液配置后需过滤后使用，并且饱和的染液不容易着色，因此对于油红O需严格按照说明书稀释使用。 诱导时间不足导致没有脂滴，部分细胞如脐带干细胞诱导时间超过30 d，并且不易观察到脂滴形成；需根据具体细胞优化诱导时间。 2.背景过深 洗涤不足，导致背景深；需优化洗涤次数和时间，并且染色结束后可适当使用60%异丙醇洗涤10 s。 染色时间过长导致背景加重，油红O染色时间一般控制在30 min以内，可通过预实验优化最佳染色时间。 3.细胞大量死亡 细胞状态差，诱导期间培养基更换不及时导致细胞死亡。铺板前观察细胞状态，并使用台盼蓝染色检测细胞活率。 换液时动作粗暴，对细胞造成物理损伤而死亡。保持动作轻柔，换液时沿孔壁缓慢加入培养基。