代谢酶 UPP1 如何跨界调控肿瘤免疫？
文献信息 | 标题 | UPP1 promotes lung adenocarcinoma progression through the induction of an immunosuppressive microenvironment |
期刊 | Nature Communications | |
分区 | 中科院一区 | |
影响因子 | 15.7 | |
摘要 | The complexity of the tumor microenvironment (TME) is a crucial factor in lung adenocarcinoma (LUAD) progression. To gain deeper insights into molecular mechanisms of LUAD, we perform an integrative single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data analysis of 377,574 cells from 117 LUAD patient samples. By linking scRNA-seq data with bulk gene expression data, we identify a cluster of prognostic-related UPP1high tumor cells. These cells, primarily situated at the invasive front of tumors, display a stronger association with the immunosuppressive components in the TME. Our cytokine array analysis reveals that the upregulation of UPP1 in tumor cells leads to the increased release of various immunosuppressive cytokines, with TGF-β1 being particularly prominent. Furthermore, this UPP1 upregulation also elevates the expression of PD-L1 through the PI3K/AKT/mTOR pathway, which contributes to the suppression of CD8 + T cells. Cytometry by time-of-flight (CyTOF) analysis provides additional evidence of the role of UPP1 in shaping the immunosuppressive nature of the TME. Using patient-derived organoids (PDOs), we discover that UPP1high tumors exhibit relatively increased sensitivity to Bosutinib and Dasatinib. Collectively, our study highlights the immunosuppressive role of UPP1 in LUAD, and these findings may provide insights into the molecular features of LUAD and facilitate the development of personalized treatment strategies. |
一、研究背景
在全球癌症致死性疾病谱系中，肺癌始终占据首位，肺腺癌（LUAD）作为肺癌最主要的组织学亚型，其发病率与致死率常年居高不下，严重威胁人类生命健康。尽管近年来靶向治疗、免疫治疗等新型诊疗手段不断迭代更新，极大改善了肺腺癌患者的临床治疗格局，但多数患者仍存在肿瘤微环境异质性强、治疗获得性耐药、个体治疗响应差异大等问题，整体预后效果依旧不理想，因此深入挖掘肺腺癌进展的分子机制、探寻新型预后标志物与精准治疗靶点，是突破当前临床治疗瓶颈的关键。肿瘤微环境（TME）的复杂重塑是驱动肺腺癌发生、侵袭、转移及免疫逃逸的核心因素，肿瘤细胞与微环境中免疫细胞、基质细胞的异常互作，会持续塑造免疫抑制性微环境，阻断机体抗肿瘤免疫应答。尿苷磷酸化酶1（UPP1）是介导尿苷代谢、维持细胞嘧啶补救合成稳态的关键酶，既往研究证实其可调控肿瘤糖酵解代谢，助力营养匮乏条件下肿瘤细胞的存活与增殖，且初步发现其与肿瘤免疫检查点、抗肿瘤T细胞浸润存在潜在关联，但UPP1在肺腺癌微环境重塑中的具体作用、分子调控通路及临床转化价值尚未被系统阐明。基于此，Li团队于2024年在《Nature Communications》发表题为《UPP1 promotes lung adenocarcinoma progression through the induction of an immunosuppressive microenvironment》的研究，依托多组学整合分析与多维度实验验证，系统性解析了UPP1介导肺腺癌免疫抑制微环境形成、推动肿瘤进展的核心机制，为肺腺癌预后评估与个体化免疫治疗提供了全新的理论依据。
二、研究方法
本研究采用多组学整合分析与体内外功能验证相结合的综合性研究体系，首先整合5个独立肺腺癌单细胞RNA测序数据集，纳入117例肺腺癌患者样本、共计377574个细胞，经数据整合、标准化、批次效应去除等质控处理后，完成细胞分群与肿瘤细胞亚群鉴定，结合单样本基因集富集分析、生存分析筛选出与患者不良预后密切相关的UPP1高表达肿瘤细胞亚群，并通过功能富集分析预判其生物学功能。研究依托复旦大学中山医院205例肺腺癌患者的组织芯片队列，利用免疫组化染色与AI图像分析技术，验证UPP1表达与患者总生存期、无复发生存期及肿瘤分化程度的关联。同时借助多重免疫荧光染色、细胞通讯分析明确UPP1高表达肿瘤细胞与微环境免疫、基质细胞的空间分布与互作关系，通过高通量细胞因子芯片、ELISA实验筛选UPP1调控的核心免疫抑制细胞因子，并利用Transwell共培养体系验证UPP1通过靶因子调控各类微环境细胞表型的机制。研究进一步通过流式细胞术、CyTOF质谱流式技术，从细胞层面解析UPP1对肿瘤微环境免疫谱系、基质细胞的重塑作用，结合免疫健全与免疫缺陷小鼠模型验证UPP1介导的体内免疫逃逸效应。此外，研究整合CTRP、GDSC、PRISM三大药物基因组学数据集进行药物筛选，结合细胞实验、患者来源类器官（PDO）模型及小鼠体内给药实验，验证UPP1高表达肺腺癌的潜在靶向药物，最后通过通路干预实验明确UPP1调控靶基因的分子信号通路。
三、研究结果分析
3.1 鉴定UPP1高表达肿瘤细胞亚群的预后价值与功能特征
本研究通过大规模单细胞测序数据整合分析，精准刻画了肺腺癌肿瘤微环境的细胞图谱，在完成免疫细胞、基质细胞、肿瘤细胞等八大细胞类群精准分群后，进一步将肿瘤细胞细分为20个具有独特分子特征的亚群，结合大宗临床样本的生存预后数据逐一验证各亚群与患者预后的关联，最终筛选出7个显著驱动肺腺癌不良预后的肿瘤细胞亚群，其中UPP1高表达的16号肿瘤细胞亚群展现出极强的预后预测价值，且该亚群的研究此前存在明显空白。功能富集分析结果显示，UPP1高表达肿瘤细胞同时富集双重促癌功能模块，一方面显著激活肿瘤侵袭转移、糖酵解代谢重编程、MYC靶基因、MAPK等经典肿瘤固有恶性通路，支撑肿瘤增殖、侵袭与耐药；另一方面显著富集TGF-β信号通路、炎症反应、免疫应答负性调控等微环境重塑相关通路，充分说明UPP1并非仅调控肿瘤细胞固有恶性表型，还深度参与肿瘤免疫微环境的抑制性重塑。更为关键的是，针对该亚群前10位核心特征基因的相关性分析证实，UPP1基因表达水平与该肿瘤亚群的整体功能富集评分呈现最强正相关，是主导该亚群恶性增殖、免疫抑制双重表型的核心驱动基因。依托临床组织样本的大样本队列验证结果进一步证实，UPP1在肺腺癌组织中的高表达状态，与患者总生存期、无复发生存期的缩短显著负相关，同时与肿瘤低分化的恶性病理特征密切相关，从临床层面夯实了UPP1作为肺腺癌不良预后新型标志物的核心价值，也为后续探索其调控肿瘤微环境的机制奠定了基础。
3.2 UPP1高表达肿瘤细胞特异性重塑免疫抑制性肿瘤微环境
肿瘤细胞的空间分布特征往往决定其恶性功能，本研究通过多重免疫荧光染色结合AI可视化分析发现，UPP1高表达肿瘤细胞并非均匀分布于肿瘤组织内部，而是特异性聚集在肿瘤侵袭前沿区域，这一特殊位置使其能够直接与肿瘤边界的免疫细胞、基质细胞产生交互作用，成为重塑微环境的核心节点。为系统阐明UPP1高表达肿瘤细胞的微环境互作网络，研究系统性分析了其与各类免疫细胞、基质细胞的共富集模式、丰度相关性及空间距离关系，结果证实UPP1高表达肿瘤细胞与四大类典型促癌、免疫抑制细胞存在显著的空间共定位与近距离分布特征，分别为FOXP3+调节性T细胞、MMP11+癌相关成纤维细胞、LAG3+PDCD1+耗竭型CD8+T细胞、SPP1+M2型巨噬细胞。相较于UPP1低表达肿瘤细胞，UPP1高表达肿瘤细胞与上述四类抑制性细胞的空间距离显著缩短，在肿瘤侵袭前沿形成了局部密集、稳定的免疫抑制细胞微生态巢，为肿瘤免疫逃逸与浸润生长提供了结构基础。进一步的CellphoneDB细胞通讯分析从分子层面精准解析了双向信号互作机制，UPP1高表达肿瘤细胞可通过多套配体受体对构建复杂的抑制性信号网络：通过PD-L1/PD-1、FGL1/LAG3、NECTIN/TIGIT经典免疫检查点通路，直接结合并抑制T细胞的抗肿瘤杀伤功能；通过TGFB1-TGFBR、IL2-IL2R细胞因子通路主动诱导免疫抑制细胞活化增殖；同时通过CCL2/CCR2、CXCL8/CXCR1趋化因子通路与生长因子通路，持续招募巨噬细胞、成纤维细胞向肿瘤侵袭前沿浸润聚集。上述多层次、多维度结果共同证实，UPP1高表达肿瘤细胞并非被动适应肿瘤微环境，而是主动通过空间特异性定植、抑制性细胞招募、双向信号交互等方式，主动构建一个以自身为核心的免疫抑制微环境，为肿瘤持续增殖、局部侵袭、免疫逃逸及远期复发转移创造了绝佳的微环境条件。
3.3 UPP1依赖TGF-β1通路介导全方位免疫抑制微环境形成
为解开UPP1重塑免疫抑制微环境的核心分子密码，研究通过高通量细胞因子芯片筛选发现，UPP1过表达的肺腺癌肿瘤细胞会大量分泌多种免疫抑制性细胞因子，其中TGF-β1的上调幅度最为显著，成为UPP1调控微环境的核心效应因子，ELISA实验也从蛋白分泌层面验证了这一结果。为真实模拟体内肿瘤细胞与微环境细胞的生理性间接互作场景，规避直接共培养的实验偏差，研究构建了多组Transwell间接共培养体系，分别将UPP1过表达肿瘤细胞与CD4+T细胞、CD8+T细胞、THP-1源性巨噬细胞、肺成纤维细胞单独共培养，并增设TGF-β1中和抗体阻断实验组与IgG对照组，严谨验证TGF-β1在UPP1介导微环境重塑中的核心介导作用。结果发现UPP1高表达肿瘤细胞分泌的TGF-β1能够全方位调控各类免疫及基质细胞的表型极化。在适应性免疫层面，TGF-β1可诱导CD4+T细胞向免疫抑制型Treg细胞分化，同时促使CD8+T细胞高表达PD-1、LAG3等耗竭标志物，丧失抗肿瘤杀伤功能；在固有免疫层面，TGF-β1能够驱动THP-1来源的巨噬细胞向SPP1+M2型促癌巨噬细胞极化，上调PD-L1、CD163等免疫抑制标志物；在基质重塑层面，TGF-β1可诱导成纤维细胞转化为高表达FAP、MMP11的癌相关成纤维细胞，激活细胞外基质重塑、上皮间质转化等促癌程序。而通过中和抗体阻断TGF-β1功能后，上述所有免疫抑制、促癌表型均被显著逆转，完整证实了UPP1通过激活TGF-β1分泌，从免疫细胞、基质细胞双维度构建免疫抑制微环境的核心机制，清晰串联起UPP1、核心细胞因子、微环境细胞表型重塑的完整调控链条。
3.4 UPP1通过PI3K/AKT/mTOR通路上调PD-L1促进肿瘤免疫逃逸
免疫检查点PD-L1的异常高表达是肺腺癌肿瘤细胞实现免疫逃逸、产生临床免疫治疗耐药的核心机制，也是当前肿瘤免疫调控研究的核心热点。为全面探索UPP1参与肿瘤免疫逃逸的另一关键途径，本研究打破单一组学局限，整合单细胞测序、临床大宗bulk转录组、CCLE肿瘤细胞系mRNA及蛋白多维度数据库，交叉验证UPP1与各类肿瘤免疫检查点分子的表达相关性，结果发现UPP1表达水平与肺腺癌肿瘤细胞PD-L1表达在转录、蛋白、单细胞多个层面均呈现显著正相关，提示二者存在稳定且紧密的特异性调控关联。为深度挖掘UPP1调控PD-L1表达的上游分子机制，研究针对UPP1高表达肿瘤细胞开展经典PD-L1调控通路的富集筛查，在六大已知调控通路中，PI3K/AKT/mTOR信号通路呈现显著的特异性高激活状态，被确定为介导UPP1调控PD-L1的核心通路。后续分子生物学实验逐级验证该调控链条：UPP1的异常上调可显著促进PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化修饰，持续激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，进而从转录水平与蛋白水平双重驱动PD-L1的高表达；而特异性抑制UPP1表达后，PI3K/AKT/mTOR通路活性显著下调，PD-L1表达随之降低。更为关键的是，通过AKT特异性激活剂SC79进行通路回复实验，可有效逆转UPP1抑制导致的PD-L1下调表型，从“抑制-激活-回复”三维实验角度，明确证实了UPP1通过激活PI3K/AKT/mTOR通路正向调控PD-L1表达的线性分子机制。功能层面的细胞杀伤实验进一步验证，高UPP1表达导致的PD-L1上调，会显著抑制CD8+T细胞的穿孔素、颗粒酶B等杀伤效应分子分泌，降低CD8+T细胞对肿瘤细胞的清除能力，而阻断PD-L1可有效恢复T细胞的抗肿瘤活性，从分子机制与免疫功能层面，完善了UPP1介导肿瘤免疫逃逸的另一重要途径，补充了UPP1调控肿瘤微环境的多通路机制。
3.5 CyTOF质谱流式全景验证UPP1的体内免疫抑制功能
为规避体外细胞实验微环境单一、缺乏体内免疫稳态与基质交互的局限性，进一步在真实体内环境中验证UPP1的免疫抑制功能，研究采用CyTOF质谱流式技术，选取21个肿瘤微环境核心蛋白标志物，对UPP1过表达与对照组小鼠肿瘤组织进行全景式免疫图谱解析，从整体层面刻画UPP1对体内肿瘤微环境免疫谱系与基质组分的重塑作用。免疫细胞亚群分析结果显示，UPP1高表达肿瘤微环境的免疫格局发生显著抑制性重塑：免疫抑制型CD25+FOXP3+Treg细胞浸润比例显著升高，且该类细胞的IL-10免疫抑制因子分泌能力显著增强，持续压制局部抗肿瘤免疫；而机体核心抗肿瘤效应细胞CD8+T细胞呈现典型的重度耗竭表型，PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4等多重免疫检查点分子同步高表达，同时TNF-α、IFN-γ等抗肿瘤效应细胞因子分泌大幅下降，彻底丧失肿瘤杀伤功能。在髓系免疫细胞层面，UPP1过表达可显著促进肿瘤微环境中CD163+PD-L1+M2型巨噬细胞的浸润与极化，该类细胞可大量分泌IL-4、IL-10等抗炎、促癌因子，进一步放大微环境的整体免疫抑制态势，形成免疫抑制的正反馈环路。在基质重塑层面，UPP1可显著促进肿瘤微环境中成纤维细胞的浸润与活化，诱导成纤维细胞高表达MMP11、FAP等癌相关成纤维细胞特征标志物，加速肿瘤细胞外基质重塑、纤维化与侵袭转移进程。本研究通过全景式、无偏向性的体内免疫质谱检测，直观、全面地证实了UPP1可在真实体内环境中重塑抑制性肿瘤微环境，从动物层面夯实了前期体外分子机制与细胞功能实验的可靠性，为UPP1作为促癌、免疫逃逸核心靶点提供了扎实的体内实验证据。
3.6 抑制UPP1可增强CD8+T细胞功能并增敏抗PD-L1免疫治疗
基于UPP1双重调控TGF-β1与PD-L1、介导免疫抑制微环境与肿瘤免疫逃逸的核心机制，研究进一步聚焦临床转化价值，探索UPP1靶向干预联合免疫治疗的增效潜力，为解决肺腺癌免疫治疗耐药难题提供新策略。研究通过构建稳定UPP1敲低的肺腺癌小鼠荷瘤模型，分组设置空白对照、单纯抗PD-L1免疫治疗、单纯UPP1抑制、UPP1抑制联合抗PD-L1治疗四组，系统对比不同干预方式的抗肿瘤效果与免疫微环境改变。体内实验结果显示，单独使用抗PD-L1免疫治疗对肺腺癌肿瘤的生长抑制效果有限，存在显著的临床常见免疫治疗耐药现象，究其原因是肿瘤微环境中存在大量Treg细胞、耗竭T细胞、M2巨噬细胞等多重免疫抑制屏障，单一阻断PD-L1无法解除整体免疫抑制状态。单纯特异性敲低肿瘤细胞UPP1表达即可显著抑制肿瘤体内增殖生长，同时有效重塑肿瘤微环境，大幅提升微环境中浸润CD8+T细胞的数量与比例，显著恢复CD8+T细胞穿孔素、颗粒酶B、TNF-α、IFN-γ等抗肿瘤效应分子的分泌水平，有效逆转CD8+T细胞耗竭状态，解除局部免疫抑制。最具临床价值的是，UPP1靶向抑制与抗PD-L1免疫治疗联合干预后，两组分展现出极强的协同抗肿瘤效应，肿瘤增殖抑制率、肿瘤消退程度均显著优于所有单一治疗组，可最大程度解除肿瘤微环境的多重免疫抑制屏障，彻底唤醒机体系统性抗肿瘤免疫应答。该部分结果充分证实UPP1是肺腺癌免疫治疗耐药的关键驱动因子，靶向抑制UPP1能够有效破除肿瘤微环境免疫抑制屏障、逆转免疫耐药、显著增敏抗PD-L1免疫治疗，为肺腺癌临床个体化联合免疫治疗提供了全新、可靠的转化策略。
3.7 生物信息学筛选并验证UPP1高表达肺腺癌的靶向药物
为实现基于UPP1表达分层的肺腺癌精准个体化治疗，填补UPP1高表达肺腺癌缺乏特异性靶向药物的临床空白，研究依托CTRP、GDSC、PRISM三大国际权威药物基因组学数据库，结合大样本肺腺癌患者基因表达与药物敏感性数据，针对UPP1高表达与低表达亚群进行药物敏感性差异分层分析，初步筛选出博舒替尼、达沙替尼、厄洛替尼三种对UPP1高表达肺腺癌具有潜在特异性杀伤效果的小分子靶向药物。为验证生信筛选结果的可靠性，研究首先开展体外细胞功能验证，结果显示相较于UPP1低表达肺腺癌肿瘤细胞，UPP1高表达肿瘤细胞对博舒替尼、达沙替尼两种Src激酶抑制剂的药物敏感性显著提升，细胞增殖抑制率、凋亡水平显著升高，而厄洛替尼对不同UPP1表达水平的肿瘤细胞无显著疗效差异，排除其特异性靶向价值。为最大程度贴近临床真实肿瘤生物学特征，规避普通细胞系与临床肿瘤的异质性差异，研究构建6例临床肺腺癌患者来源的PDO类器官模型，保留患者肿瘤的原始基因特征、病理表型与药物反应特征。PDO药物干预结果与细胞实验高度一致，UPP1表达水平越高的患者类器官，对博舒替尼、达沙替尼的药物响应越显著，类器官增殖抑制效果越明显，充分验证了两种药物的靶向特异性。最后研究通过小鼠体内荷瘤给药模型进行最终药效验证，结果证实博舒替尼、达沙替尼可特异性抑制UPP1高表达肺腺癌的体内生长，有效阻滞肿瘤增殖进展，且毒副作用可控。本部分研究从大数据生信筛选、体外细胞验证、临床类器官模型模拟到动物体内药效验证，层层递进、多维度完成药物有效性验证，为UPP1阳性肺腺癌患者的分层精准靶向治疗提供了明确、可靠的候选药物。
四、研究总结
本研究依托大样本多组学整合分析与多层次体内外实验，系统阐明了UPP1作为肺腺癌新型预后标志物与促癌核心因子的双重作用，完整揭示了UPP1通过多通路、多维度重塑肺腺癌免疫抑制微环境、驱动肿瘤进展的分子机制，同时挖掘了对应的临床治疗策略，具备极高的基础研究价值与临床转化意义。研究首先通过单细胞测序成功界定了预后不良的UPP1高表达肿瘤细胞亚群，证实UPP1高表达肿瘤细胞定位于肿瘤侵袭前沿，可通过细胞间信号交互主动招募Treg细胞、耗竭型CD8+T细胞、M2型巨噬细胞、癌相关成纤维细胞等免疫抑制细胞，构建促癌微环境。机制层面明确了两条核心调控通路：一方面UPP1高表达可诱导肿瘤细胞大量分泌TGF-β1，全方位介导免疫细胞、基质细胞的促癌表型极化；另一方面通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路上调PD-L1表达，直接诱导CD8+T细胞耗竭、介导肿瘤免疫逃逸，双重通路共同推动肺腺癌的恶性进展与免疫耐药。体内CyTOF全景免疫图谱、小鼠模型实验进一步夯实了UPP1的免疫抑制功能，证实靶向沉默UPP1可有效恢复机体抗肿瘤免疫、增敏抗PD-L1免疫治疗。此外，研究创新性结合药物基因组学筛选、患者来源类器官与动物模型验证，确定博舒替尼、达沙替尼是UPP1高表达肺腺癌的特异性靶向药物，为患者分层精准治疗提供了全新方向。整体而言，该研究完善了肺腺癌肿瘤微环境的调控理论，但研究并未进一步探索UPP1代谢功能与免疫调控功能的交叉关联，且药物联合免疫治疗的远期疗效与安全性仍需大样本临床队列验证，为后续深入研究与临床应用留下了探索空间。
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