成脂诱导实验介绍

细胞成脂诱导实验详解

肥胖的特征是脂肪组织的质量或功能随着能量获取和消耗的失衡而增加，它与糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝和某些癌症等代谢性疾病密切相关。脂肪库的扩张（尤其是白色脂肪组织）以脂肪细胞体积增加（肥大）或由前体细胞形成新脂肪细胞（增生）为特征。因此诱导细胞成脂在肥胖相关疾病的机制研究和药物开发中发挥重要的作用。

成脂分化（Adipogenic Differentiation）是间充质干细胞（MSCs）或前脂肪细胞在特定条件下诱导分化为成熟脂肪细胞的过程，可以通过油红O染色染色评估脂肪分化程度。3T3-L1是成脂分化最常用的细胞类型。

Tips

脂肪可分为白色脂肪和棕色脂肪

 成熟白色脂肪细胞含有许多体积较大的单房脂滴，细胞呈多边形，细胞核位于细胞的边缘，并含有少量的线粒体。marker基因包括Agt、Retn/Resistin、Slc2a4/Glut4、Cfd/Adiposin、Adipoq/Adiponectin及Fabp4/aP2。

 棕色脂肪细胞含有多房小脂滴，是富含线粒体的一种产热细胞。marker基因包括DIO2、PPARα、PRDM16及UCP1等。

细胞选择

 3T3-L1：成脂定向性和重复性好；但属于小鼠来源细胞，与人源具有一定差异。

 hMSCs：人源骨髓MSCs，临床相关性高，但分化效率低（30%左右）。

 hADSCs：人脂肪来源间充质干细胞，分化效率高效，但供体个体差异大。

成脂分化实验步骤（以RC0044产品诱导3T3-L1为例）

1. 取对数生长期的细胞，按照2.0×10e4 cells/cm2 的细胞密度接种至培养器皿，于37℃，5% CO2 培养环境下培养至汇合度90~100%。

2. 弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液于37℃，5% CO2 培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

3. 吸去培养基使用适量 1×PBS 清洗一次，弃去后取适量 4%多聚甲醛(PFA)溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60 min，弃去固定液再使用1×PBS 清洗两次。

4. 取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液（油红O原液: 生理盐水=3:2），配制后过滤使用，现用现配。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红O工作液，静置染色30 min。吸走油红O工作液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。

5. 显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红O染料结合后呈现红色或橘红色。

EnkiLife成脂诱导培养基诱导出来的照片

图1.成脂诱导后油红O染色效果图_20.0x-1（100 um）

图2.成脂诱导后油红O染色效果图_20.0x-2（100 um）

图3.未经成脂诱导油红O染色效果图_20.0x-1（100 um）

图4.未经成脂诱导油红O染色效果图_20.0x-2（100 um）

常见问题及解析

1. 脂滴形成少

 细胞密度不足，未达到接触抑制导致诱导失败；在进行成脂诱导时需确保细胞生长至90~100%密度时再开始诱导。

 诱导剂失效导致诱导失败；胰岛素需避光保存并避免反复冻融；地塞米松需避光保存。

 4%多聚甲醛(PFA)固定过度导致脂滴结构被破坏，固定时间一般为30-60 min；建议根据结果优化固定时间。

 油红O染液结晶导致染色失败；油红O染液配置后需过滤后使用，并且饱和的染液不容易着色，因此对于油红O需严格按照说明书稀释使用。

 诱导时间不足导致没有脂滴，部分细胞如脐带干细胞诱导时间超过30 d，并且不易观察到脂滴形成；需根据具体细胞优化诱导时间。

2. 背景过深

 洗涤不足，导致背景深；需优化洗涤次数和时间，并且染色结束后可适当使用60%异丙醇洗涤10 s。

 染色时间过长导致背景加重，油红O染色时间一般控制在30 min以内，可通过预实验优化最佳染色时间。

3. 细胞大量死亡

 细胞状态差，诱导期间培养基更换不及时导致细胞死亡。铺板前观察细胞状态，并使用台盼蓝染色检测细胞活率。

 换液时动作粗暴，对细胞造成物理损伤而死亡。保持动作轻柔，换液时沿孔壁缓慢加入培养基。

推荐产品

品牌名称	产品名称	产品货号
EnkiLife	小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞3T3-L1	CXM00276
EnkiLife	3T3-L1（脂肪前体细胞）成脂诱导分化培养套装（即用型）	RC0044
EnkiLife	3T3-L1（脂肪前体细胞）成脂诱导分化培养套装	RC0043

细胞成脂诱导