TSA-mIF用于肿瘤免疫微环境分析

用于肿瘤免疫微环境（TIME）分析的TSA-mIF

背景

癌症与宿主免疫系统的相互作用主要发生在肿瘤周围的反应性组织基质中，这一区域被称为肿瘤免疫微环境（TIME）。免疫检查点抑制剂，特别是针对程序性死亡蛋白1（PD-1，一种T细胞共抑制受体）和程序性死亡配体1（PD-L1，也称为B7-H1/CD274）的靶向治疗的突破性临床应用，不仅将癌症免疫治疗推向了新时代，也使得TIME的功能分析成为研究和临床实践的核心。精确表征TIME的细胞组成、功能状态和分子相互作用网络是筛选免疫治疗反应预测性生物标志物的关键前提。此外，深入阐明TIME中各种免疫细胞的促癌/抗癌双重机制及其与肿瘤细胞的动态关联，可以为开发新型免疫治疗策略提供核心支持。然而，肿瘤微环境（TIME）的高度异质性以及低丰度免疫分子检测的挑战，对传统分析技术提出了严峻的挑战，迫切需要高灵敏度、多重靶向的原位检测工具来克服这一难题。

                                                                               肿瘤微环境（TME）^[1]

优势

一个多世纪以来，苏木精-伊红染色（HE染色）一直是病理学家在显微镜下观察活检和手术标本中淋巴细胞、癌细胞核、腺体和其他组织结构的经典方法。其形态学特征为疾病分级和诊断提供了关键证据。免疫组织化学（IHC）是分析雌激素受体和人表皮生长因子受体2等临床标志物的常规方法，但两者在肿瘤微环境研究中均存在明显的局限性——HE染色无法准确识别免疫细胞亚群和功能分子，而标准IHC每个切片只能检测一种标志物，难以捕捉肿瘤微环境中多细胞相互作用和分子网络的复杂特征。近年来，基于酪胺信号放大（TSA）原理的多重免疫荧光技术（mIF）彻底解决了这一难题。该技术的核心策略为“单标记抗体标记—辣根过氧化物酶（HRP）催化荧光标记的酪胺分子与靶表位共价结合—抗体洗脱进行多轮循环染色”，结合多光谱成像显微扫描和人工智能图像分析，可同时检测单个组织切片上的5-10个标记物。它不仅能够准确识别CD8⁺T细胞、调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞等免疫亚群，并实现对低丰度免疫检查点分子（如PD-1/PD-L1）的高灵敏度检测，还能完整保留原位组织结构，量化细胞间的空间邻近关系和相互作用模式。它解决了传统技术难以同时获取“细胞分型-功能表型-空间分布”多维信息的问题，为分析肿瘤免疫抑制机制、筛选免疫治疗反应生物标志物以及发现三级淋巴结构（TLS）等关键功能区域提供了强有力的技术支持，成为肿瘤免疫学研究和精准诊疗转化的核心工具。案例Maltseva等人利用基于TSA的多重免疫荧光技术，

系统地分析了免疫治疗有效组和无效组患者的肿瘤免疫细胞组成和PD-1表达特征。该研究通过inForm表型分析软件实现了细胞的精确鉴定和分类，确保了数据分析的客观性和高效性。该实验选取了一组靶向抗体，包括CD8、PD-1、CD20、CD163和FoxP3抗体，分别靶向细胞毒性T淋巴细胞、免疫检查点分子、B淋巴细胞、促肿瘤表型巨噬细胞和调节性T细胞。细胞核用DAPI染色，并用抗荧光淬灭封片剂处理以维持信号稳定性。在定量分析阶段，选取10个具有代表性的视野（200倍放大），计算上述免疫细胞占肿瘤结节内总基质细胞（不包括肿瘤细胞周围的基质和三级淋巴结构）的百分比。通过多色标记（CD8

⁺细胞绿色，CD20⁺细胞黄色，CD163⁺细胞红色，Treg细胞橙色，PD-1表达白色，细胞核蓝色），直观地呈现细胞浸润模式。同时，本研究利用InForm软件将单标记数据转化为免疫组化模拟图谱，以进一步辅助结果解读。凭借TSA技术的高灵敏度和多重检测优势，本研究清晰地揭示了不同治疗反应组患者肿瘤微环境的差异，为免疫治疗反应生物标志物的筛选提供了直接的实验证据，并证实了TSA多重免疫荧光技术在临床样本中肿瘤微环境深度分析的核心应用价值。图1 CD8⁺细胞毒性淋巴细胞、CD20⁺ B淋巴细胞、FoxP3⁺调节性T细胞和CD163⁺巨噬细胞在治疗反应组（A）和非治疗反应组（B）中的肿瘤浸润情况

[2]在一项关于非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤免疫微环境的研究中，Peng等人^{本研究采用多重免疫荧光技术，系统分析了肿瘤巢（TN）和肿瘤间质（TS）中10种免疫标志物的表达特征及其相互作用关系。结果显示，肿瘤间质内存在多种强相关性的免疫细胞相互作用：间质CD20⁺B细胞与间质CD4⁺CD38⁺T细胞、FOXP3⁺中性粒细胞、间质中性粒细胞与肿瘤内调节性T细胞、肿瘤内CD38⁺T细胞与肿瘤内CD20⁺B细胞、肿瘤内CD8⁺T细胞与肿瘤内PD-L1表达的M2巨噬细胞、以及肿瘤内PD-L1⁺细胞与肿瘤内CD8⁺T细胞。此外，该研究发现肿瘤内 CD133}+

细胞与肿瘤内 M1 巨噬细胞之间存在中等程度的相关性，尤其是不表达 PD-L1 的 M1 巨噬细胞。这表明肿瘤内巨噬细胞可能在介导 CD8⁺T 细胞耗竭型免疫反应中发挥作用。利用多重免疫荧光技术的多重检测优势，本研究清晰地描绘了非小细胞肺癌 (NSCLC) 的肿瘤间免疫图谱和细胞相互作用网络，为后续机制探索和治疗靶点筛选提供了重要参考。^{图 2 非小细胞肺癌中 10 种免疫标志物的表达谱。该图显示了单个和合并的免疫荧光图像以及病理切片。}[3]在一项组织芯片 (TMA) 研究中，Mori 等人使用优化的多重免疫荧光方案（IP1 和 IP2）对支气管气道肿瘤和乳腺癌 TMA 样本进行了染色。使用inForm软件完成多光谱图像解混和分析，同时生成模拟DAB染色的“病理视图”以辅助结果解读。其中，IP1方案可同时识别肿瘤微环境（TME）中的5种细胞类型（CD3⁺ T细胞、CD20⁺ B细胞、CD3⁺ FOXP3⁺调节性T细胞、CD117⁺ CK⁻肥大细胞、CK⁺上皮/肿瘤细胞）。结合Ki67染色，可以评估细胞增殖状态，并通过CD117和CK的共定位区分不同的细胞亚群。 IP2方案聚焦于4种核心细胞类型（CD3⁺CD8⁻T细胞、CD3⁺CD8⁺细胞毒性T细胞、CD68⁺巨噬细胞和CK⁺上皮/肿瘤细胞），并整合了PD-1/PD-L1免疫检查点分子检测，成功捕捉了乳腺癌样本中PD-L1⁺CD68⁺巨噬细胞和PD-1⁺T细胞的共定位特征。通过结合标准化的mIF方案和TMA技术，本研究高效地实现了对多种肿瘤样本中肿瘤微环境（TME）细胞组成、功能状态和免疫分子相互作用的系统分析，为高通量临床样本肿瘤微环境（TIME）研究提供了一条可行的途径。图 3 人支气管气道活检组织微阵列，采用两种多重免疫荧光方案 IP1 (a) 和 IP2 (b) 进行染色^[4].^{EnkiLife 可为客户提供 TSA 免疫组化和免疫荧光切片分析服务，包括阳性细胞计数分析、共定位分析、邻近分析、细胞密度分析、肿瘤细胞浸润分析等。}产品^产品编号TSA 六标七色多重免疫组化试剂盒^RA10012TSA 五标六色多重免疫组化试剂盒^RA10011TSA 四标五色多重免疫组化试剂盒^RA10010TSA 三标四色多重免疫组化试剂盒^RA10009TSA 双标三色多重免疫组化试剂盒RA10008详情请见

TSA mIHC 试剂盒^参考文献1. Rojas F, Hernandez S, Lazcano R, Laberiano-Fernandez C, Parra ER.多重免疫荧光和数字图像分析工作流程在转化研究中评估肿瘤免疫微环境的应用。Front Oncol. 2022年6月27日;12:889886。doi: 10.3389/fonc.2022.889886。PMID: 35832550; PMCID: PMC9271766。

2. Maltseva A, Kalinchuk A, Chernorubashkina N, Sisakyan V, Lots I, Gofman A, Anzhiganova Y, Martynova E, Zukov R, Aleksandrova E, Kolomiets L, Tashireva L. 通过肿瘤免疫微环境预测子宫内膜癌免疫靶向治疗的反应：一项多中心观察性研究。Int J Mol Sci. 2024年4月1日；25(7):3933。doi: 10.3390/ijms25073933。PMID: 38612743；PMCID: PMC11011874。3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. 利用多重免疫荧光分析非小细胞肺癌的肿瘤免疫微环境。Front Immunol. 2021年11月4日；12:750046。doi: 10.3389/fimmu.2021.750046。PMID: 34804034；PMCID: PMC8600321。4. Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. 利用酪胺多重免疫荧光技术表征肿瘤免疫微环境。乳腺生物学与肿瘤学杂志。2020年12月；25(4):417-432。doi: 10.1007/s10911-021-09479-2。2021年2月15日在线发表。PMID: 33590360；PMCID: PMC7960613。⁺T cells, CD20⁺B cells, CD3⁺FOXP3⁺regulatory T cells, CD117⁺CK⁻mast cells, CK⁺epithelial/tumor cells). Combined with Ki67 staining, cell proliferation status can be evaluated, and different cell subsets can be distinguished through co-localization of CD117 and CK. The IP2 protocol focuses on 4 core cell types (CD3⁺CD8⁻T cells, CD3⁺CD8⁺cytotoxic T cells, CD68⁺macrophages, CK⁺epithelial/tumor cells) and incorporates PD-1/PD-L1 immune checkpoint molecule detection, successfully capturing the co-localization characteristics of PD-L1⁺CD68⁺macrophages and PD-1⁺T cells in breast cancer samples. Through the combination of standardized mIF protocols and TMA technology, this study efficiently achieved systematic analysis of TME cell composition, functional status, and immune molecule interactions in multiple types of tumor samples, providing a feasible path for high-throughput clinical sample TIME research.

Figure 3  Human bronchial airway biopsy tissue microarrays stained using two multiplex immunofluorescence protocols, IP1 (a) and IP2 (b)^[4].

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References

1. Rojas F, Hernandez S, Lazcano R, Laberiano-Fernandez C, Parra ER. Multiplex Immunofluorescence and the Digital Image Analysis Workflow for Evaluation of the Tumor Immune Environment in Translational Research. Front Oncol. 2022 Jun 27;12:889886. doi: 10.3389/fonc.2022.889886. PMID: 35832550; PMCID: PMC9271766.

2. Maltseva A, Kalinchuk A, Chernorubashkina N, Sisakyan V, Lots I, Gofman A, Anzhiganova Y, Martynova E, Zukov R, Aleksandrova E, Kolomiets L, Tashireva L. Predicting Response to Immunotargeted Therapy in Endometrial Cancer via Tumor Immune Microenvironment: A Multicenter, Observational Study. Int J Mol Sci. 2024 Apr 1;25(7):3933. doi: 10.3390/ijms25073933. PMID: 38612743; PMCID: PMC11011874.

3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. Profiling Tumor Immune Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer Using Multiplex Immunofluorescence. Front Immunol. 2021 Nov 4;12:750046. doi: 10.3389/fimmu.2021.750046. PMID: 34804034; PMCID: PMC8600321.

4. Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. Characterizing the Tumor Immune Microenvironment with Tyramide-Based Multiplex Immunofluorescence. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2020 Dec;25(4):417-432. doi: 10.1007/s10911-021-09479-2. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33590360; PMCID: PMC7960613.